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La sclérose latérale amyotrophique (SLA), maladie mortelle du motoneurone, se caractérise par une dégénérescence progressive des MN. Les MN phréniques (phMN) qui contrôlent l'activité du diaphragme sont susceptibles de dégénérer dans la SLA, entraînant la mort par insuffisance respiratoire. La compréhension des mécanismes de dégénérescence des MN phréniques dans la SLA est limitée, principalement en raison de l'absence de modèles expérimentaux humains permettant d'étudier les MN phréniques. Nous décrivons ici une méthode permettant d'obtenir des MN de type phrénique à partir d'iPSC humaines (hiPSC-phMN) en 30 jours. Ce protocole utilise une combinaison optimisée de petites molécules suivie d'un tri cellulaire basé sur une protéine de surface cellulaire enrichie dans les hiPSC-phMNs, et est hautement reproductible en utilisant plusieurs lignées hiPSC. Nous montrons en outre que les hiPSC-phMNs portant l'amplification du gène C9orf72 associée à la SLA perdent progressivement leur activité électrophysiologique et subissent une mortalité accrue par rapport aux contrôles isogéniques. Ces études établissent un protocole jusqu'alors inexistant pour générer des phMNs humaines, offrant un système pertinent pour étudier les mécanismes de dysfonctionnement des MNs respiratoires.

Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) dérivées d'individus sains et malades peuvent donner naissance à de nombreux types de cellules, ce qui facilite l'étude des mécanismes de développement, la modélisation des maladies humaines et la validation précoce des cibles médicamenteuses. Dans ce contexte, des systèmes modèles expérimentaux basés sur des motoneurones (MN) dérivés de hiPSC ont été utilisés pour étudier les maladies MN telles que l'atrophie musculaire spinale et la sclérose latérale amyotrophique. La modélisation des maladies des MN à l'aide d'approches basées sur les hiPSC nécessite des conditions de culture capables de récapituler dans un plat les événements qui sous-tendent la différenciation, la maturation, le vieillissement et la mort des MN. Les applications actuelles basées sur les MN dérivées des hiPSC sont souvent entravées par les limites de notre capacité à surveiller la morphologie, la survie et d'autres propriétés fonctionnelles des MN sur une période prolongée, ce qui souligne la nécessité d'améliorer les conditions de culture à long terme. Nous décrivons ici une méthode basée sur un substrat dendritique de polyglycérol amine (dPGA) cytocompatible pour la culture prolongée de MNs dérivées de hiPSC. Nous démontrons que les MNs cultivés sur des plats recouverts de dPGA se prêtent mieux à l'étude à long terme de la viabilité cellulaire, de l'identité moléculaire et de l'activité électrophysiologique spontanée du réseau. La présente étude a le potentiel d'améliorer les études basées sur les hiPSC de la biologie et de la maladie des MN humains.Nous décrivons l'utilisation d'un nouveau substrat de revêtement offrant des conditions améliorées pour les cultures à long terme des motoneurones humains dérivés des iPSC, permettant ainsi l'évaluation de la viabilité cellulaire, de l'identité moléculaire, de l'activité électrophysiologique spontanée du réseau et du séquençage de l'ARN unicellulaire des motoneurones matures.

La culture cellulaire stable à long terme est un outil essentiel pour mieux comprendre la fonction cellulaire. La plupart des modèles de culture cellulaire adhérente nécessitent un substrat polymère recouvert de poly-lysine ou de poly-ornithine pour que les cellules adhèrent et survivent. Cependant, les substrats à base de polypeptides sont dégradés par protéolyse et il reste difficile de maintenir des cultures cellulaires saines pendant de longues périodes. Nous rapportons ici le développement d'un substrat de culture cellulaire amélioré basé sur un revêtement de polyglycérol amine dendritique (dPGA), un biomimétique macromoléculaire non protéique de la poly-lysine, pour promouvoir l'adhésion et la survie des neurones dans la culture cellulaire. Nous montrons que ce nouveau revêtement polymère améliore la survie, la différenciation et la stabilité à long terme des cultures de neurones primaires ou de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). L'analyse par microscopie à force atomique montre qu'une plus grande rugosité à l'échelle nanométrique contribue à l'amélioration de la capacité des surfaces revêtues de dPGA à supporter les cellules en culture. Nous concluons que le dPGA est une alternative cytocompatible, fonctionnellement supérieure, facile à utiliser, peu coûteuse et très stable aux revêtements de substrats de culture cellulaire en polymères poly-cationiques tels que la poly-lysine et la poly-ornithine.