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Tips for Keeping Primary Neuron Cultures Healthy

Conseils pour maintenir les cultures de neurones primaires en bonne santé

Nous avons tous connu des cultures de neurones primaires qui ont mal tourné. Compte tenu des nombreuses étapes du processus d'obtention et de culture de ces neurones, il peut être difficile de mettre le doigt sur le problème. Voici un guide pour vous aider à dépanner votre culture de neurones primaires à chaque étape.

Caractéristiques d'une culture saine

À quoi doit ressembler une culture de neurones primaires corticaux ou hippocampiques en bonne santé ? Dans une culture saine, les neurones doivent adhérer à la surface du puits dans l'heure qui suit l'ensemencement et, au cours des deux premiers jours de culture, ils doivent présenter des processus mineurs étendus et des signes d'excroissance axonale1,2. Au bout de quatre jours, les neurones doivent présenter une excroissance dendritique et au bout d'une semaine, ils doivent commencer à former un réseau mature1. Les cultures de neurones primaires sains doivent pouvoir être maintenues de manière reproductible au-delà de 3 semaines3.

Qu'en est-il des cellules gliales ?

Dans le cerveau, les neurones dépendent fortement des cellules gliales pour leur soutien trophique4. Cela complique les systèmes de culture neuronale, car les cellules gliales prolifèrent et peuvent dépasser les neurones5. Certaines méthodes cultivent les neurones à côté d'une couche nourricière gliale pour permettre un soutien trophique sans croissance excessive des neurones, mais cela peut compliquer la mise en place de la culture4. Avec le milieu Neurobasal et les suppléments appropriés, les cultures neuronales à long terme peuvent être maintenues à long terme sans cellules nourricières et avec une croissance gliale relativement minimale3,6. Si le maintien d'une culture neuronale très pure avec très peu de contamination par les cellules gliales est nécessaire pour vos expériences, l'utilisation de cytosine arabinoside (AraC) est une méthode établie pour inhiber la prolifération gliale5. Toutefois, l'AraC a été signalé comme ayant des effets neurotoxiques hors cible et ne devrait être utilisé qu'en cas de nécessité et à de faibles concentrations.

Méthodes de dissection

Les cultures primaires de neurones présentent de nombreux avantages par rapport aux lignées cellulaires immortelles, car elles sont plus stables sur le plan génétique et plus proches des cellules neuronales post-mitotiques3. Cependant, cela présente l'inconvénient de devoir obtenir des neurones primaires à partir d'une dissection pour chaque nouvelle culture. Si vos neurones n'adhèrent pas ou ne présentent pas de signes d'excroissance dans les premiers temps suivant la dissection, cela peut être un indicateur de dommages cellulaires survenus lors de la dissection.

L'âge de l'animal est un élément à prendre en compte pour optimiser le processus de dissection. Les cultures primaires de neurones peuvent être générées à partir de la fin du stade embryonnaire jusqu'au début du stade postnatal, mais les cultures embryonnaires sont généralement préférées en raison d'une plus faible densité de cellules gliales et d'une arborisation moins définie qui empêche le cisaillement des cellules au cours de la dissection4,7. Pour cette raison, le stade E17-19 est le plus souvent utilisé dans les protocoles de culture de neurones primaires de rat3,4. Si l'utilisation de neurones embryonnaires est compatible avec vos expériences, envisagez d'utiliser ce moment pour obtenir des cellules plus saines.

Une fois le tissu disséqué, une étape clé est la dissociation du tissu. Bien que cette opération soit généralement réalisée à l'aide de trypsine combinée à une trituration mécanique, il a été démontré que la trypsine peut entraîner une dégradation de l'ARN3,8. Si vous remarquez des problèmes avec la santé précoce de vos neurones, envisagez d'utiliser la papaïne comme enzyme de digestion alternative, ou pour les neurones corticaux, essayez de dissocier par trituration mécanique seule3. La trituration mécanique pour dissocier le tissu doit être douce et éviter les bulles pour éviter le cisaillement par la tension de surface3,9. Laisser les neurones se reposer après la dissociation peut également améliorer le processus d'ensemencement3.

Densité

Les neurones cultivés sont plus heureux et plus sains lorsqu'ils sont cultivés à une densité plus élevée. Il est essentiel d'établir une densité cellulaire appropriée pour créer une culture capable de se différencier et de former un réseau mature. La densité idéale dépend du type de cellule et de l'expérience prévue ; cependant, les lignes directrices suivantes sont des lignes directrices générales pour les densités d'ensemencement des neurones primaires de rat3 :

Pour les neurones corticaux :

  • Expériences de biochimie : 120 000/cm2
  • Histologie : 25 000 - 60 000/cm2

Pour les neurones hippocampiques :

  • Expériences de biochimie : 60 000/cm2
  • Histologie : 25 000 - 60 000/cm2

Substrats d'enrobage

Les neurones primaires ne peuvent pas se développer directement sur le plastique ou le verre et ont besoin d'un substrat de croissance pour adhérer à la surface du puits. Si vos neurones s'empilent en amas et poussent les uns sur les autres, c'est le signe que votre substrat d'enrobage est en train de se dégrader10. Les substrats de revêtement les plus couramment utilisés sont la poly-D-lysine (PDL) et la poly-L-lysine (PLL), qui sont des chaînes homopolymériques de l'acide aminé lysine chargé positivement3,4,9,11. La PDL est formée à partir de l'énantiomère D-lysine et est plus résistante à la dégradation enzymatique par des protéases telles que la trypsine12,13. Si vous rencontrez des problèmes de dégradation du substrat avec la PLL, essayez de la remplacer par la PDL. Si les problèmes de dégradation du substrat persistent avec la PDL, envisagez de passer à la dPGA, un substrat de croissance alternatif qui imite la structure de la poly-lysine, mais qui est dépourvu de liaisons peptidiques, ce qui le rend très résistant à la dégradation2.

Milieu et suppléments

Un dernier élément à prendre en compte lors du dépannage de votre culture de neurones primaires est le milieu et le sérum. Pour maintenir des concentrations contrôlées d'hormones, de facteurs de croissance et de nutriments, les cultures de neurones primaires doivent être maintenues dans un milieu de culture sans sérum6. Le DMEM normal permet la croissance gliale, c'est pourquoi le Neurobasal, une version du DMEM optimisée pour les neurones, est le plus souvent utilisé avec un supplément de B27 et de L-glutamine ou de Glutamax3,4,6. Des suppléments antibiotiques tels que la pénicilline/streptomycine sont généralement ajoutés pour contrôler la contamination, mais ils peuvent altérer les propriétés neuronales telles que l'activité électrique et ne doivent être utilisés que s'ils n'ont pas d'impact sur les résultats expérimentaux14. Le milieu doit être préparé une fois par semaine avec des suppléments nouvellement dilués provenant de stocks congelés9. Pour contrer l'évaporation et fournir des nutriments en continu, le milieu doit être renouvelé tous les 3 à 7 jours3,4.

Références

  1. Dotti, C., Sullivan, C. & Banker, G. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454–1468 (1988).
  2. Clément, J.-P. et al. Dendritic Polyglycerol Amine: An Enhanced Substrate to Support Long-Term Neural Cell Culture. ASN Neuro 14, 17590914211073276 (2022).
  3. Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S. & Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signal. 3, NS20180207 (2019).
  4. Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P. & Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. J. Vis. Exp. JoVE 55000 (2017) doi:10.3791/55000.
  5. Lesslich, H. M., Klapal, L., Wilke, J., Haak, A. & Dietzel, I. D. Adjusting the neuron to astrocyte ratio with cytostatics in hippocampal cell cultures from postnatal rats: A comparison of cytarabino furanoside (AraC) and 5-fluoro-2’-deoxyuridine (FUdR). PLOS ONE 17, e0265084 (2022).
  6. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K. & Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented neurobasalTM, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567–576 (1993).
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  8. Vrtačnik, P., Kos, Š., Bustin, S. A., Marc, J. & Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Anal. Biochem. 463, 38–44 (2014).
  9. Brewer, G. J. & Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat. Protoc. 2, 1490–1498 (2007).
  10. Thiry, L., Clément, J.-P., Haag, R., Kennedy, T. E. & Stifani, S. Optimization of Long-Term Human iPSC-Derived Spinal Motor Neuron Culture Using a Dendritic Polyglycerol Amine-Based Substrate. ASN Neuro 14, 17590914211073381 (2022).
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  12. Tsuyuki, E., Tsuyuki, H. & Stahmann, M. A. THE SYNTHESIS AND ENZYMATIC HYDROLYSIS OF POLY-d-LYSINE. J. Biol. Chem. 222, 479–485 (1956).
  13. Li, J. & Yeung, E. Real-Time Single-Molecule Kinetics of Trypsin Proteolysis. https://pubs.acs.org/doi/epdf/10.1021/ac801365c (2008) doi:10.1021/ac801365c.
  14. Bahrami, F. & Janahmadi, M. Antibiotic Supplements Affect Electrophysiological Properties and Excitability of Rat Hippocampal Pyramidal Neurons in Primary Culture. Iran. Biomed. J. 17, 101–106 (2013).