La science derrière le revêtement des surfaces de culture cellulaire

La science derrière le revêtement des surfaces de culture cellulaire

La croissance cellulaire in vivo nécessite la présence de la matrice extracellulaire (MEC), un échafaudage externe de protéines qui soutient la structure et la fonction cellulaires1. Un aspect important de la traduction des conditions de croissance pour la culture cellulaire est la reproduction de cette couche de soutien in vitro. Bien que certaines lignées cellulaires immortelles puissent se développer directement sur des surfaces en verre ou en plastique de culture tissulaire, de nombreuses lignées cellulaires primaires ou dérivées d'iPSC sont incapables d'adhérer ou de survivre sur ces matériaux et ont besoin d'un substrat de croissance qui imite les propriétés de l'ECM1-3. La technologie du revêtement des cultures cellulaires a considérablement évolué au fil des ans.

Composants purifiés de la MEC

Une des premières solutions pour reproduire la MEC in vitro consistait à extraire des composants individuels de la MEC elle-même1,4. Les composants de la MEC extraits comprenaient le collagène, la fibronectine et la laminine. Les premières études visant à incorporer des protéines purifiées de la MEC dans la culture cellulaire ont observé des améliorations significatives de la santé et de la durée de vie de la culture1. Cependant, ce processus d'extraction est difficile, coûteux et sujet à des variations entre les lots1,2.

Polypeptides synthétiques

Il s'avère que les cellules n'ont pas besoin d'une réplique exacte de l'ECM pour se développer in vitro, mais plutôt d'une surface de croissance contenant une forte densité de charges positives5. On peut y parvenir en recouvrant les surfaces de culture de polymères composés d'acides aminés basiques. On pense que les surfaces chargées positivement favorisent l'adhésion cellulaire par l'interaction avec les protéoglycanes à base d'héparane sulfate (HSPG) à la surface des cellules6,7. Les HSPG chargés négativement ont de fortes interactions électrostatiques avec les acides aminés basiques et sont importants pour l'adhésion cellulaire par le biais d'interactions avec l'ECM in vivo.

Ces observations ont ouvert la voie à l'utilisation de polypeptides synthétiques comme substrats de revêtement alternatifs peu coûteux5. Les plus couramment utilisés en culture cellulaire sont la poly-lysine et la poly-ornithine (PLO). Ces molécules sont de longues chaînes d'acides aminés chargés positivement, la lysine et l'ornithine, respectivement5. La poly-lysine possède deux énantiomères, la poly-L-lysine (PLL) et la poly-D-lysine (PDL). L'énantiomère d est utilisé de préférence par de nombreuses personnes en raison de sa plus grande résistance à la dégradation enzymatique par les protéases sécrétées8,9. Ces substrats artificiels se sont avérés efficaces pour l'adhérence et la prolifération de nombreux types de cellules5,10,11. Cependant, certaines applications, telles que la culture de cellules dérivées de l'iPSC, nécessitent un substrat de croissance supplémentaire. Ces cellules sont généralement cultivées avec une couche de laminine sur une couche de PLO, ou avec une couche de Matrigel12,13.

Conditions optimales pour le revêtement des surfaces

Ces cellules sont généralement cultivées avec une couche de laminine sur une couche de PLO, ou avec une couche de Matrigel12,13. En raison de la forte teneur en charge positive de ces polypeptides synthétiques tels que la poly-lysine et la poly-ornithine, ils sont mieux adsorbés sur des matériaux chargés négativement (tels que la silice, votre verre de laboratoire typique))14. De même, les plaques et les plats en plastique traités au TC sont faits de polystyrène qui a été traité, généralement avec du plasma, pour présenter des charges plus négatives sur sa surface afin de faciliter l'adsorption des polypeptides synthétiques ainsi que l'adsorption non spécifique des protéines sériques contenues dans le milieu(https://doi.org/10.1089/ten.teb.2018.0056).

En outre, l'adsorption de PLL et PLO est mieux réalisée dans une solution basique, qui réduit la répulsion électrostatique au sein du polymère, lui permettant d'adopter une conformation en hélice α14,15.

Les composants purifiés de la MEC et les polypeptides synthétiques sont des substrats efficaces pour la croissance et l'adhésion des cellules in vitro, mais ils sont composés de liaisons peptidiques et sont donc susceptibles d'être dégradés par les protéases sécrétées par les cellules2. En particulier dans les cultures à long terme, la dégradation du substrat de revêtement peut entraîner l'agrégation des cellules en amas, ce qui perturbe la stabilité et la viabilité de la culture2,16.

Polymères non peptidiques

Les composants purifiés de la MEC et les polypeptides synthétiques sont des substrats efficaces pour la croissance et l'adhésion des cellules in vitro, mais ils sont composés de liaisons peptidiques et sont donc susceptibles d'être dégradés par les protéases sécrétées par les cellules2. En particulier dans les cultures à long terme, la dégradation du substrat d'enrobage peut entraîner l'agrégation des cellules en amas, ce qui perturbe la stabilité et la viabilité de la culture2,16.

Pour résoudre le problème de la dégradation du revêtement, nous avons mis au point un nouveau revêtement polymère synthétique à base de polyglycérol aminé dendritique (dPGA). Ces polymères conservent la forte densité de charge positive qui favorise l'adhésion cellulaire, mais ils sont dépourvus de liaisons peptidiques et résistent donc à la dégradation par les protéases cellulaires. Testés dans divers systèmes de culture neuronale, ces polymères non peptidiques soutiennent l'attachement et la prolifération cellulaires avec une efficacité égale ou supérieure à celle des polypeptides synthétiques2,3,16.

Références

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