Les meilleurs revêtements pour les réseaux multi-électrodes

Les meilleurs revêtements pour les réseaux multi-électrodes

Les réseaux multi-électrodes (MEA) sont des grilles de petites électrodes qui permettent l'enregistrement extracellulaire ou la stimulation de nombreux neurones cardiaques et neuronaux simultanément1. Nous abordons ici les MEA 2D conçus pour l'enregistrement in vitro de cellules cultivées ou de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), mais les MEA peuvent également être conçus pour l'implantation et l'enregistrement in vivo de populations de cellules dans le cerveau. Les MEA in vitro enregistrent les fluctuations électrochimiques dans le champ extracellulaire autour des neurones, produites par l'échange d'ions pendant les potentiels d'action2. Ce dispositif non invasif permet des études à long terme de l'activité des réseaux neuronaux avec une résolution temporelle et spatiale relativement élevée et une perturbation limitée du système. Avec l'avènement des plaques multi-puits incorporant jusqu'à 96 MEA distinctes dans des puits individuels, les MEA sont devenues un outil puissant pour les essais de multiplexage visant à étudier l'effet d'un traitement sur les propriétés électrophysiologiques des cellules cardiaques et neuronales.

L'un des principaux défis des expériences MEA est de pouvoir détecter des signaux électrophysiologiques cellulaires à partir du plus grand nombre possible d'électrodes dans le réseau et de pouvoir maintenir ces canaux actifs au cours de sessions d'enregistrement étalées sur plusieurs jours. Les électrodes MEA in vitro sont généralement implantées dans une base en verre pour la culture cellulaire1.

La clé pour maintenir un nombre élevé de canaux actifs stables à long terme dans vos expériences du MEA est d'utiliser un revêtement qui favorise l'adhésion cellulaire à long terme sans dégradation3. Si le substrat de revêtement est dégradé, les cellules se détachent du substrat où se trouvent les électrodes et commencent à se superposer en amas4. Cet effet est particulièrement problématique pour les MEA, car l'agglutination des cellules réduit la probabilité qu'une cellule électrophysiologiquement active se trouve sur ou à proximité d'un site d'électrode, ce qui nécessite une séparation spatiale des cellules pour distinguer les signaux électriques à travers le réseau.

Types de revêtements des MEA

Les électrodes MEA in vitro sont généralement intégrées dans une base en verre ou en polystyrène qui n'est généralement pas propice à l'adhésion des cellules cultivées1. Par conséquent, la plupart des protocoles d'MEA nécessitent un revêtement initial du MEA avant l'ensemencement des cellules. La polyornithine et la poly-lysine sont des revêtements typiques pour les cellules neuronales. Cependant, ces deux revêtements contiennent des liaisons peptidiques et sont vulnérables à la dégradation par les protéases sécrétées8. Le polyéthylèneimine (PEI) est un autre substrat d'enrobage que l'on retrouve dans de nombreux protocoles de MEA. Il imite les propriétés d'adhésion de ces polypeptides mais ne contient pas de liaisons peptidiques et est donc plus résistant à la dégradation.  Comme tous les polymères cationiques, il doit être enrobé de polyéthylèneimine (PEI), un revêtement standard utilisé dans de nombreux protocoles de MEA, complété par de la laminine ou une autre protéine de la matrice extracellulaire pour les cultures d'iPSC, qui présente un regroupement cellulaire réduit par rapport à la polylysine1,5. Cependant, le PEI présente une différenciation neuronale, une maturation et une réactivité électrique réduites par rapport au substrat polypeptidique synthétique standard, la poly-dl-ornithine (PDLO)3. D'autres substrats d'enrobage courants pour les cultures MEA iPSC comprennent la laminine seule ou la poly-ornithine (PLO) PLO utilisée avec la laminine, mais chacun de ces substrats est susceptible de se dégrader et d'entraîner l'agrégation des cellules dans les études à long terme4,6,7. 

La polyornithine et la poly-dl-ornithine contiennent toutes deux des liaisons peptidiques et sont vulnérables à la dégradation par les protéases sécrétées8. D'autres substrats d'enrobage (comme le PEI) imitent les propriétés d'adhésion de ces polypeptides, mais ne contiennent pas de liaisons peptidiques et sont donc plus résistants à la dégradation. Le polyglycérol aminé dendritique (dPGA) est un autre polymère non peptidique qui favorise efficacement l'adhésion cellulaire à long terme pour de nombreuses cultures neuronales et iPSC. Contrairement au PEI, le dPGA favorise la différenciation et la maturation des cellules à des niveaux comparables, et parfois supérieurs, à ceux des substrats polypeptidiques4,8. Lorsqu'il est utilisé avec le Matrigel comme substrat de revêtement MEA pour les motoneurones dérivés des iPSC, le dPGA permet des cultures à long terme avec un minimum de regroupement, ce qui se traduit par une augmentation du nombre et de la fréquence des pointes enregistrées4.  

Références

1. Pelkonen, A. et al. Functional Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Models of the Brain with Microelectrode Arrays. Cells 11, 106 (2021).
2. Ahmadvand, T., Mirsadeghi, S., Shanehsazzadeh, F., Kiani, S. & Fardmanesh, M. A Novel Low-Cost Method for Fabrication of 2D Multi-Electrode Array (MEA) to Evaluate Functionality of Neuronal Cells. Proceedings 60, 51 (2020).
3. Amin, H. et al. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front. Neurosci. 10, (2016).
4. Thiry, L., Clément, J.-P., Haag, R., Kennedy, T. E. & Stifani, S. Optimization of Long-Term Human iPSC-Derived Spinal Motor Neuron Culture Using a Dendritic Polyglycerol Amine-Based Substrate. ASN Neuro 14, 17590914211073381 (2022).
5. Hales, C. M., Rolston, J. D. & Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). JoVE (Journal of Visualized Experiments) e2056 (2010) doi:10.3791/2056.
6. Kuijlaars, J. et al. Sustained synchronized neuronal network activity in a human astrocyte co-culture system. Sci Rep 6, 36529 (2016).
7. Thiry, L., Hamel, R., Pluchino, S., Durcan, T. & Stifani, S. Characterization of Human iPSC-derived Spinal Motor Neurons by Single-cell RNA Sequencing. Neuroscience 450, 57–70 (2020).
8. Clément, J.-P. et al. Dendritic Polyglycerol Amine: An Enhanced Substrate to Support Long-Term Neural Cell Culture. ASN Neuro 14, 17590914211073276 (2022).