Avantages du dPGA comme revêtement de substrat de culture cellulaire

Qu'est-ce que le dPGA ?

De nombreuses conditions biologiques doivent être reproduites pour que des cellules dissociées saines puissent se développer en culture. Un facteur important pour la croissance cellulaire in vivo est la matrice extracellulaire (MEC), l'échafaudage externe de protéines qui soutient la structure et la fonction cellulaires1. Bien que certaines lignées cellulaires immortelles puissent même se développer directement sur des surfaces en verre ou en plastique de culture tissulaire, de nombreuses lignées cellulaires primaires ou dérivées de l'iPSC sont incapables d'adhérer à ces matériaux et ont besoin d'un substrat de croissance qui imite les propriétés de la MEC1-3.

De nombreux composants de la MEC ont été purifiés et isolés pour être utilisés dans la culture cellulaire, mais ce processus est coûteux et difficile1. Les cellules adhèrent généralement aux protéines à forte teneur en acides aminés chargés positivement. Des polypeptides synthétiques ont donc été créés et utilisés comme substrats d'enrobage alternatifs peu coûteux4. La poly-lysine et la poly-ornithine (PLO) sont de longues chaînes homopolymériques d'acides aminés chargés positivement, la lysine et l'ornithine, respectivement4. La poly-lysine possède deux énantiomères, la poly-L-lysine (PLL) et la poly-D-lysine (PDL), cette dernière étant utilisée de préférence pour les cultures neuronales primaires en raison de sa plus grande résistance à la dégradation enzymatique5,6. En raison de la nature à long terme de la différenciation de certaines cellules telles que les iPSC humaines et de nombreuses cellules dérivées des iPSC, ces cellules nécessitent un substrat de croissance supplémentaire et sont généralement cultivées avec une couche de laminine sur une couche de PLO, ou avec une couche supplémentaire de Matrigel7,8.

Les polypeptides synthétiques contiennent des liaisons peptidiques, de sorte que ces substrats d'enrobage peuvent être dégradés par les protéases libérées par les cellules cultivées2,3,5. C'est là qu'interviennent les polyglycérols amines dendritiques (dPGA). Contrairement à la poly-lysine et à la poly-ornithine, le dPGA ne comporte pas de liaisons peptidiques, ce qui le rend résistant à la protéolyse2. Cette famille de polymères a une structure très ramifiée avec de nombreux groupes fonctionnels amine et présente une forte densité de charges positives à pH neutre, reproduisant ainsi la nature positive des acides aminés des substrats polypeptidiques synthétiques9,10. Contrairement à la poly-lysine et à la poly-ornithine, le dPGA ne comporte pas de liaisons peptidiques, ce qui le rend résistant à la protéolyse2. Son architecture unique et sa résistance à la dégradation font du dPGA un substrat de croissance optimal pour de nombreuses lignées cellulaires et expériences de culture cellulaire.

Quels types de cellules peuvent être cultivés sur le dPGA et bénéficier du DPGA ?

Pratiquement toutes les cellules adhérentes peuvent être cultivées sur dPGA, qu'il s'agisse de lignées cellulaires, de cellules primaires ou de cellules dérivées de l'iPSC, mais nous avons constaté que le dPGA présente plusieurs avantages pour les cultures de cellules neuronales :

Neurones corticaux et hippocampiques primaires de rat : lorsqu'ils sont cultivés sur des plaques revêtues de dPGA, les neurones corticaux primaires ont une physiologie et des propriétés électriques normales. Comparées aux cultures sur plaques recouvertes de PDL, les cultures de neurones dPGA sont 50 % plus denses à 7 DIV et presque 300 % plus denses à 90 DIV2.

Neurones corticaux dérivés d'iPSC : lorsque le dPGA est utilisé pour remplacer la couche de base PLO sous une couche de matrice de laminine, les neurones corticaux dérivés d'iPSC sont plus sains, comme le montre la microscopie à contraste de phase, et ont une densité neuronale plus élevée2.

Neurones dopaminergiques dérivés des iPSC : lorsque le dPGA est utilisé à la place du PLO, ces cultures ont un rendement plus élevé en neurones dopaminergiques et présentent un regroupement cellulaire réduit2.

Neurones hippocampiques dérivés d'iPSC : lorsque le dPGA est utilisé à la place du PLO, les neurones hippocampiques présentent une réduction significative de la formation de grappes2.

Motoneurones dérivés d'iPSC : lorsqu'ils sont cultivés sur dPGA + Matrigel, les motoneurones dérivés d'iPSC présentent une différenciation similaire, une réduction significative de l'agglutination et une augmentation de l'adhérence d'un facteur 5 par rapport au Matrigel seul. Ces cultures peuvent être maintenues sur dPGA + Matrigel pendant 2 mois sans agglutination11.

Neurones sensoriels dérivés d'iPSC : des données non publiées montrent que des cultures de neurones sensoriels sains dérivés d'iPSC peuvent également être maintenues en utilisant le dPGA comme substrat de croissance.

Comment le dPGA peut-il améliorer vos cultures cellulaires ?

Augmentation de la longévité des cultures

La capacité à maintenir des cultures de cellules neuronales à long terme est particulièrement importante pour la modélisation in vitro du dysfonctionnement neuronal et de la dégénérescence dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)12,13. Le dPGA étant plus résistant à la dégradation par les protéases, il est mieux à même de supporter des cultures à long terme, comme cela a été observé dans les neurones corticaux primaires à 90 DIV et dans les neurones moteurs dérivés de l'iPSC à 2 mois après l'ensemencement2,11.

Une culture plus saine

Les neurones corticaux primaires cultivés sur dPGA présentent une densité cellulaire plus élevée dès 3 jours de culture2 et une mortalité cellulaire réduite. L'analyse des données scRNAseq des motoneurones dérivés d'iPSC cultivés sur dPGA + Matrigel montre une réduction significative du nombre de cellules endommagées et de cellules en cours de mort cellulaire, par rapport aux cultures cultivées sur Matrigel seul11.

Promotion de la différenciation des lignées cellulaires dérivées de l'iPSC

Lorsque le dPGA est utilisé à la place du PLO comme substrat de culture, les neurones corticaux primaires dérivés de l'iPSC présentent une augmentation du ratio neurones/glies, ce qui suggère une préférence pour la différenciation neuronale2. De même, les neurones dopaminergiques dérivés d'iPSC présentent un ratio plus élevé de neurones dopaminergiques positifs à la tyrosine hydroxylase (TH) par rapport aux neurones TH négatifs, ce qui suggère que le dPGA favorise également cette différenciation ciblée2. Ces preuves indiquent que la dPGA favorise la différenciation précoce des progéniteurs neuronaux dans le type de neurones prévu avec certains protocoles de différenciation.

Réduction de la formation de grappes

Lorsque les substrats de croissance des cultures cellulaires sont dégradés, les cellules ont tendance à s'agglutiner et à adhérer les unes aux autres11. Il a été démontré que l'utilisation du dPGA comme substrat de croissance réduisait l'agglutination des cellules dans les neurones dopaminergiques, hippocampiques et moteurs dérivés d'iPSC2,11. La capacité d'isoler des cellules individuelles en culture est importante pour de nombreux types d'essais, y compris les mesures électrophysiologiques2, 11, l'analyse microscopique de l'analyse morphologique à l'imagerie des cellules vivantes, ainsi que des mesures pour tester la composition de la culture, tels que les essais de cellule unique comme le séquençage de l'ARN (scRNAseq) 11. L'analyse des données scRNAseq de motoneurones dérivés d'iPSC cultivés avec dPGA + Matrigel montre une réduction significative du nombre de cellules endommagées et de cellules en cours de mort cellulaire, par rapport aux cultures cultivées sur Matrigel seul11.

Amélioration du revêtement des réseaux multi-électrodes (MEA)

La réduction de l'agglutination des cellules a également des implications importantes pour l'utilisation des réseaux multi-électrodes (MEA) dans la culture cellulaire. Les MEA permettent la caractérisation électrophysiologique de grandes populations de neurones en détectant les tensions extracellulaires, mais l'agrégation des cellules entraîne un faible nombre d'électrodes à proximité suffisante pour l'enregistrement11. Testées avec des motoneurones dérivés de l'iPSC, les cellules cultivées avec le dPGA sont restées uniformément réparties sur les plaques MEA, tandis que celles cultivées avec le Matrigel seul ont formé de grands amas de cellules 11. Par conséquent, les 16 électrodes de la plaque dPGA + Matrigel sont restées à proximité des cellules pendant la période d'enregistrement de 3 semaines, ce qui s'est traduit par une augmentation du nombre et de la fréquence des pointes enregistrées11.

Promotion de la différenciation de la lignée cellulaire dérivée de l'iPSC

Lorsque le dPGA est utilisé à la place du PLO comme substrat de culture, les neurones corticaux primaires dérivés de l'iPSC présentent une augmentation du rapport neurones/glies, ce qui suggère une préférence pour la différenciation neuronale2. De même, les neurones dopaminergiques dérivés d'iPSC présentent un ratio plus élevé de neurones dopaminergiques positifs à la tyrosine hydroxylase (TH) par rapport aux neurones TH négatifs, ce qui suggère que le dPGA favorise également cette différenciation ciblée2. Ces données indiquent que la dPGA favorise la différenciation précoce des progéniteurs neuronaux dans le type de neurones prévu avec certains protocoles de différenciation.

Références

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