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The possible causes of cells dying in cell culture

Les causes possibles de la mort des cellules en culture cellulaire

Les causes possibles de la mort des cellules en culture cellulaire

Pourquoi mes cellules meurent-elles ?

Si vous avez passé un peu de temps à travailler avec des cellules en culture, il y a de fortes chances que vous vous soyez posé cette question. Les cellules cultivées peuvent être capricieuses et de nombreux facteurs peuvent avoir un impact sur leur santé et leur viabilité. Voici une liste des sources courantes de mortalité des cultures cellulaires, qui vous aidera à identifier les problèmes afin que vos cultures puissent prospérer.

Incubation

Les incubateurs sont essentiels pour contrôler la température, les échanges gazeux et l'humidité des cultures cellulaires, ce qui a un impact direct sur l'osmolalité et le pH du milieu de culture cellulaire1. Même de légères fluctuations de la température et du taux d'évaporation peuvent avoir des effets profonds sur la santé des cellules.

L'impact le plus important sur la température est l'ouverture et la fermeture fréquentes de la porte de l'incubateur, qui peut entraîner des baisses de température significatives1. Pour remédier à ce problème, il faut envisager d'utiliser des incubateurs supplémentaires pour différentes expériences afin de réduire le trafic. Nous disposons généralement d'un incubateur pour les expériences qui nécessitent des entrées et sorties fréquentes de l'incubateur (comme les essais à court terme qui durent de 1 à 3 heures ou le passage des cellules) et d'un incubateur séparé pour les cultures à long terme ou les cultures de cellules très précieuses ou fragiles. Vous pouvez également stocker vos plaques à l'arrière de l'incubateur, où les fluctuations de température seront moins importantes.

En se développant dans un environnement chaud, les cultures cellulaires sont confrontées à un taux constant d'évaporation du milieu, ce qui entraîne une augmentation de l'osmolalité et une modification du pH1,2. Pour contrer ce phénomène, assurez-vous que le réservoir d'eau de votre incubateur est plein et veillez à effectuer des changements de milieu ou des passages suffisamment fréquents pour diminuer les effets de l'évaporation.

Milieu

Le milieu de culture cellulaire fournit les nutriments nécessaires à la croissance des cellules à l'état dissocié3,4. De nombreuses lignées cellulaires nécessitent également des additifs tels que des suppléments de facteurs de croissance, du sérum, de la L-glutamine ou des antibiotiques. Les besoins des différents types de cellules varient, il faut donc veiller à rechercher les milieux et les additifs qui conviennent à votre type de cellules. Si vous constatez la mort de cellules après l'introduction d'un réactif provenant d'un nouveau lot, inspectez-le et remplacez-le, car la formulation peut avoir changé. Lorsqu'ils sont exposés à la lumière fluorescente, de nombreux ingrédients courants des milieux cellulaires, tels que le tryptophane, la riboflavine et la tyrosine, réagissent pour créer des composés toxiques5 ; assurez-vous donc que les cellules et les milieux sont stockés dans l'obscurité, à l'abri de la lumière fluorescente. Il est également important de s'assurer que les milieux et les additifs sont frais. La plupart des milieux disponibles dans le commerce contiennent un indicateur de pH, le rouge de phénol, qui passe du jaune à un pH faible au rouge puis au rose à mesure que le pH augmente6. Si votre milieu change de couleur alors qu'il est stocké, il est temps de le remplacer par un nouveau flacon, même si la date de péremption n'est pas encore atteinte. Les changements de couleur du milieu dans vos cultures peuvent également être un bon indicateur qu'il est temps de passer vos cellules ou de changer de milieu. Certains additifs, comme la L-glutamine, sont instables et se transforment en une forme inutilisable avec le temps ; ils doivent être conservés à l'état congelé et n'être ajoutés au milieu qu'au moment de l'utilisation6.

Cryoconservation

La cryoconservation des lignées cellulaires permet de conserver un stock pour continuer à dériver de futures cultures à partir de la même lignée sans surpassement3. Toutefois, ce processus soumet les cellules à un stress et peut entraîner leur mort s'il n'est pas effectué avec précaution. Si vous remarquez une réduction significative de la viabilité des cellules lorsque vous ensemencez des cellules à partir d'un stock congelé, le problème peut provenir du processus de cryoconservation.

Les cellules doivent être congelées dès les premiers passages, à environ 80 % de confluence et à un taux de croissance exponentiel. L'utilisation d'un agent cryoprotecteur tel que le DMSO est importante pour empêcher la formation de cristaux de glace dommageables7. Le ralentissement de la vitesse de refroidissement à l'aide de récipients isolés, tels qu'un Mr. Frosty, garantira une vitesse de congélation progressive et contrôlée3.

Lors de la décongélation, réchauffez rapidement à 37°C et diluez doucement avec du milieu préchauffé3. Plaquez les cellules à une densité plus élevée que d'habitude, pour tenir compte de la mort cellulaire qui est normale pendant le processus de congélation7. Après 24 heures, les cellules doivent adhérer à la plaque.

Stress dû à la dissection et au passage

Les cellules sont particulièrement vulnérables lors de manipulations stressantes telles que la dissection et le passage. Des précautions supplémentaires lors de ces procédures peuvent améliorer le taux de survie des cellules. Lors du transfert de cellules ou du traitement de tissus disséqués, tous les composants, y compris la trypsine, le sérum et les milieux, doivent être réchauffés au moins à la température ambiante afin de minimiser le stress cellulaire3. La trypsine, utilisée pour dissocier les tissus et détacher les cellules adhérentes, peut être toxique et dommageable3,8,9. Si vous pensez que cette étape pourrait poser problème, envisagez de réduire le temps que vos cellules passent dans la trypsine, ou de trouver un agent alternatif, tel que la papaïne (pour la dissociation). Pipettez les cellules délicatement et évitez les bulles, afin de ne pas cisailler les cellules par la tension superficielle3,10. La centrifugation à grande vitesse peut également endommager les cellules. Bien que les durées et les vitesses de centrifugation varient en fonction du type de cellule, la vitesse ne doit généralement pas dépasser 100 g3.

Surpassement et densité

Le nombre de passages d'une lignée cellulaire a un impact significatif sur la fonction cellulaire et l'expression génétique11,12. Un trop grand nombre de passages peut avoir un impact sur la santé et la viabilité de vos cultures et introduire une variabilité expérimentale importante. Veillez à vous renseigner sur le nombre de passages maximum recommandé pour votre lignée cellulaire.

Les cellules en division active ont besoin d'espace pour se développer. Le surpeuplement à 100 % de confluence peut arrêter la division cellulaire et provoquer la mort des cellules7. Les cellules doivent être passées à environ 80 % de confluence alors qu'elles présentent encore un taux de croissance exponentiel afin de garantir des cultures saines. Il faut trouver un juste équilibre, car la plupart des cellules détestent pousser de manière trop éparse. Un bon guide pour la densité d'ensemencement des cellules prolifératives est disponible en ligne (en anglais) ici : https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/cell-culture-protocols/cell-culture-useful-numbers.html. Lorsque l'on fait passer des cellules à environ 80 % de confluence, le ratio de division typique se situe entre 1:3 et 1:8 une fois par semaine afin de maintenir une densité saine après le passage3.

Pour les cellules non prolifératives telles que les neurones, la densité d'ensemencement optimale varie en fonction du type de cellule et de l'expérience, mais elle doit être relativement élevée pour les cultures saines8.

Détachement

Bien que certains types de cellules puissent adhérer directement au plastique ou au verre, beaucoup ont besoin d'un substrat de croissance pour adhérer à la surface de la plaque. Si vos cellules commencent à se regrouper en amas ou à se détacher de la plaque au fil du temps, c'est le signe que votre substrat d'enrobage se dégrade14. Les substrats de revêtement les plus couramment utilisés sont la poly-lysine (PLL et PDL) et la poly-ornithine (PLO), qui sont des chaînes homopolymériques d'acides aminés chargés positivement, la lysine et l'ornithine, respectivement8,10,15,16. La PDL est formée à partir de l'énantiomère D-lysine et est plus résistante à la dégradation enzymatique par des protéases telles que la trypsine17,18 par rapport à l'énantiomère L. Si vous rencontrez des problèmes de dégradation du substrat avec la PLL, essayez de la remplacer par la PDL. Si les problèmes de dégradation du substrat persistent avec la PDL, envisagez de passer à un polymère non peptidique tel que le dPGA, qui imite la structure de la poly-lysine, mais qui est dépourvu de liaisons peptidiques, ce qui le rend très résistant à la dégradation19.

Contamination

La création d'un environnement idéal pour la culture cellulaire a pour conséquence naturelle que cet environnement est également parfait pour la croissance de contaminants indésirables tels que les bactéries, les levures et les champignons. Les signes sont parfois évidents : croissance inhabituelle, milieu trouble ou changement radical de la couleur du milieu, mais la contamination peut souvent être plus subtile3,9,13. Les mycoplasmes sont de minuscules microbes ressemblant à des bactéries, dépourvus de paroi cellulaire et pouvant atteindre une densité extrêmement élevée dans les cultures cellulaires sans aucun signe visible13. Cela peut également se produire avec des contaminations bactériennes à croissance lente, résistantes aux antibiotiques et difficiles à détecter au microscope. Dans les deux cas, ces contaminations peuvent altérer radicalement les fonctions cellulaires. Si vous observez une croissance cellulaire lente, des taux élevés de détachement ou une mort cellulaire inexplicable, une contamination mycoplasmique ou bactérienne pourrait être en cause3.

Il existe plusieurs façons de tester indirectement les contaminations par les mycoplasmes, notamment les kits PCR et les tests ELISA, mais le test le plus recommandé est la coloration au fluorochrome de l'ADN13. Dans ce test, les cellules sont fixées et colorées de manière à ce que l'ADN devienne fluorescent sous l'effet de la lumière UV. La comparaison avec des lames de contrôle positives et négatives permet d'identifier la contamination par les mycoplasmes. Ce test peut également être utilisé pour identifier tout autre contaminant microbien, y compris les contaminations bactériennes subtiles. Toute culture contaminée doit être immédiatement éliminée. Si vous rencontrez des problèmes constants de contamination, revoyez vos supports, votre technique aseptique et votre espace de travail afin d'identifier les sources potentielles de contaminants13.

Références

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  2. Chi, H.-J. et al. Effect of evaporation-induced osmotic changes in culture media in a dry-type incubator on clinical outcomes in in vitro fertilization-embryo transfer cycles. Clin Exp Reprod Med 47, 284–292 (2020).
  3. Masters, J. R. & Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc 2, 2276–2284 (2007).
  4. Philippeos, C., Hughes, R. D., Dhawan, A. & Mitry, R. R. Introduction to Cell Culture. in Human Cell Culture Protocols (eds. Mitry, R. R. & Hughes, R. D.) 1–13 (Humana Press, Totowa, NJ, 2012). doi:10.1007/978-1-61779-367-7_1.
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