Protocole de revêtement PLO/Laminine

La laminine est une protéine matricielle extracellulaire (ECM) et un composant clé de la lame basale des tissus épithéliaux du corps. Après un revêtement initial de polyornithine ou de dPGA , il est souvent nécessaire d'ajouter une deuxième couche de laminine à votre système de culture in vitro pour favoriser l'adhésion, la prolifération et la différenciation de nombreux types de cellules, notamment les cellules endothéliales, épithéliales, neurales, hépatiques et musculaires.

Matériels:

• Hydrobromure de poly-L-ornithine (PLO) - Sigma Aldrich #P3655

• Laminine de la membrane basale du sarcome murin Engelbreth-Holm-Swarm - Sigma #L2020

• PBS

Stockage/Stabilité

• Conservez la poudre ou la solution mère de PLO desséchée à -20°C.
• Conservez la laminine non diluée à -20°C jusqu'à utilisation.

Préparation du bouillon

• Dans des conditions stériles, préparer des solutions mères de 1 mg/mL de PLO dans de l'eau stérile. La solution doit être claire. Filtrer stérilement avec un filtre en Téflon de 0,22 µm. Conserver les aliquotes à -20 °C.
• Décongeler lentement la solution de laminine sur de la glace pour éviter la formation d'un gel. Dans des conditions stériles, préparer des aliquotes de travail et les conserver à -20°C.

Revêtement PLO :

1. Dans des conditions stériles, diluez le stock de PLO à 1 mg/mL jusqu'à une concentration finale de 50 µg/mL (dilution 1:20) dans du PBS stérile.
2. Ajoutez la solution PLO à votre récipient de culture.
3. Incuber les plaques à 37°C pendant la nuit.
4. Laver 3 fois avec du PBS stérile avant d'enduire de laminine.

Revêtement de laminine :

1. Décongeler lentement la partie active de la laminine sur de la glace. Éviter la formation d'un gel, car la laminine ne peut pas être réactivée si elle se gélifie.
2. Diluer le stock de laminine à la concentration souhaitée dans du PBS stérile. La concentration idéale dépend de l'application (mais une concentration de départ typique est de 1 µg/mL).
3. Ajoutez la solution de laminine à votre récipient de culture revêtu de PLO.
4. Incuber les plaques à 37°C pendant 1 heure.
5. Laver 3 fois avec du PBS stérile avant de plaquer les cellules. Conserver la surface revêtue dans du PBS, ne pas laisser la surface sécher plus de quelques minutes.

Références

Clément, J.-P., Al-Alwan, L., Glasgow, SD, Stolow, A., Ding, Y., Quevedo Melo, T., Khayachi, A., Liu, Y., Hellmund, M., Haag, R., Milnerwood, AJ, Grütter, P., & Kennedy, TE (2022). Dendritic Polyglycerol Amine : un substrat amélioré pour soutenir la culture de cellules neurales à long terme. ASN Neuro , 14 , 17590914211073276. https://doi.org/10.1177/17590914211073276